Zuiverheid versus netto peptidegehalte: waarom 99% niet 99% is

Op veel analyserapporten staat een indrukwekkend getal: purity 99%. Toch betekent dat niet dat 99% van het poeder in een flesje uit het peptide bestaat. Het verschil zit tussen twee begrippen die vaak door elkaar worden gehaald: zuiverheid en netto peptidegehalte. In dit artikel leggen we het verschil uit.

Twee verschillende vragen

• Zuiverheid (purity): hoeveel van het peptide-materiaal is het juiste peptide?
• Netto peptidegehalte (net peptide content): hoeveel van het totale gewicht van het poeder is peptide?

Dat lijkt op elkaar, maar het zijn verschillende metingen met een andere noemer.

Zuiverheid: een verhouding binnen het signaal

Zuiverheid wordt meestal gemeten met HPLC en een UV-detector. Het apparaat scheidt het monster en meet licht rond 210 tot 220 nanometer, waar de peptidebinding licht absorbeert. Het zuiverheidspercentage is het oppervlak van de hoofdpiek gedeeld door het oppervlak van alle pieken.

Wat de detector niet ziet, telt dus niet mee. Water absorbeert dat licht niet. Ook veel zouten en tegenionen geven daar weinig of geen signaal. Ze zitten wel in het poeder, maar niet in de berekening.

Zuiverheid zegt daarom vooral: van alles wat op een peptide lijkt, is zoveel procent het juiste peptide. De rest zijn bijvoorbeeld ketens waarin een aminozuur ontbreekt of die te vroeg zijn gestopt.

Netto peptidegehalte: een verhouding binnen het gewicht

Het netto peptidegehalte vergelijkt de massa van het peptide met de massa van het hele poeder. Labs bepalen dat bijvoorbeeld met elementanalyse (het meten van stikstof) of met aminozuuranalyse. In de literatuur van peptideproducenten wordt vaak genoemd dat het netto peptidegehalte van een gezuiverd peptide ergens tussen ongeveer 60 en 90 procent ligt. Dat hangt sterk af van het peptide.

Wat zit er nog meer in het poeder?

Tegenionen: TFA en acetaat

Peptiden met vrije aminogroepen vormen zouten. Bij de standaard zuivering met HPLC wordt vaak trifluorazijnzuur (TFA) gebruikt. Dat bindt aan de basische plekken van het peptide: het begin van de keten en aminozuren als arginine, lysine en histidine. Zo ontstaat een TFA-zout.

Door een extra stap (ionenuitwisseling) kan het TFA worden vervangen door bijvoorbeeld acetaat of chloride. Veel peptiden die als geneesmiddel worden gemaakt, zijn acetaatzouten. In onderzoek kom je vaak TFA-zouten tegen.

Tegenionen wegen mee. Een peptide met veel basische aminozuren kan relatief veel tegenion bevatten. Het netto peptidegehalte ligt dan lager, ook als het peptide zelf heel zuiver is.

Water

Een lyofilisaat trekt vocht aan. Afhankelijk van het peptide en de opslag kan een deel van het gewicht uit water bestaan. Labs meten water vaak met de Karl Fischer-methode.

Restoplosmiddelen en andere zouten

In kleine hoeveelheden kunnen ook resten van oplosmiddelen of buffers in het poeder zitten. Die worden met andere technieken gemeten, zoals gaschromatografie.

Een rekenvoorbeeld

Stel, een flesje bevat 10 milligram poeder. Het rapport meldt:

• zuiverheid: 98%
• netto peptidegehalte: 80%

Dan is 80% van het poeder peptide-materiaal: 8 milligram. Daarvan is 98% het juiste peptide: ongeveer 7,8 milligram. De rest van het gewicht bestaat uit tegenionen, water en eventuele andere stoffen. Dit voorbeeld laat zien waarom de twee getallen niet hetzelfde zijn. Het is geen uitspraak over een bestaand product.

Content op een rapport: nog een derde begrip

Sommige rapporten vermelden geen netto peptidegehalte, maar een gemeten hoeveelheid in milligram per flesje (content of amount). Die wordt vaak bepaald door het HPLC-signaal te vergelijken met een referentiestandaard met bekende hoeveelheid. Ook dit getal is iets anders dan zuiverheid. Een flesje kan zuiver zijn en toch minder milligram bevatten dan het etiket zegt, of juist meer. Lees hoe je dat op een rapport herkent in Hoe lees je een Janoshik-testuitslag?.

Wat betekent dit voor het lezen van een COA?

• Lees purity en content altijd als twee aparte regels.
• Ontbreekt een hoeveelheid of gehalte, dan weet je niet hoeveel peptide er in het monster zat.
• Staat er een zoutvorm vermeld (bijvoorbeeld “acetate” of “TFA salt”)? Dat verklaart een deel van het gewicht.
• Een zuiverheid van 99% en een gehalte onder het etiket kunnen allebei kloppen.

Meer achtergrond vind je in Wat is een COA? en op de pagina Laboratorium.

Veelgestelde vragen

Wat is het verschil tussen purity en content?

Purity is het aandeel van het juiste peptide in het gemeten peptide-signaal. Content is de hoeveelheid peptide in het monster, in milligram of als percentage van het gewicht.

Wat is een TFA-zout?

Een vorm van het peptide waarbij trifluorazijnzuur als tegenion aan de basische groepen is gebonden. Het komt vaak voor na zuivering met HPLC.

Is een acetaatzout beter dan een TFA-zout?

Dat hangt af van het doel van het onderzoek. Het verschil is vooral de vorm van het zout en het gewicht dat het tegenion bijdraagt. Een rapport moet duidelijk maken welke vorm is gemeten.

Waarom vermelden niet alle rapporten het netto peptidegehalte?

Omdat het een aparte meting is die niet bij elke standaardtest hoort. Staat het er niet op, dan is het niet gemeten.

PeptidePraat is een informatieplatform zonder eigen lab. Dit artikel is geen gebruiksadvies en geen medisch advies.