Wat is HPLC? Eenvoudige uitleg van de methode

HPLC is een van de meest gebruikte technieken in analytische laboratoria. Je komt de afkorting tegen op analyserapporten van geneesmiddelen, voedingsmiddelen, cosmetica en ook peptiden. Maar wat is HPLC precies, en wat zie je in zo’n grafiek met pieken? In dit artikel leggen we het zo eenvoudig mogelijk uit.

HPLC in één zin

HPLC staat voor High Performance Liquid Chromatography, in het Nederlands hogedruk-vloeistofchromatografie. Het is een methode om de stoffen in een mengsel van elkaar te scheiden en te meten.

Een vergelijking: hardlopers op een modderig parcours

Stel je een groep hardlopers voor die tegelijk starten op een parcours vol modder. Sommige lopers blijven makkelijker hangen dan andere. Aan de finish komen ze daardoor op verschillende tijden binnen. Wie de aankomsttijden noteert, kan zien hoeveel lopers er waren en wie wie is.

HPLC werkt op dezelfde manier. De stoffen in een monster zijn de lopers, de kolom is het parcours, en de detector staat bij de finish.

De onderdelen van een HPLC-systeem

Pompen en mobiele fase

Een pomp duwt een vloeistof onder hoge druk door het systeem. Die vloeistof heet de mobiele fase. Bij peptiden is dat meestal een mengsel van water en acetonitril, met een klein beetje zuur. Tijdens de meting verandert de verhouding vaak geleidelijk. Dat heet een gradiënt.

Injector

Een kleine hoeveelheid van het opgeloste monster wordt in de stroom gespoten.

Kolom

De kolom is een smalle buis gevuld met hele kleine deeltjes: de stationaire fase. Hier gebeurt de scheiding. Stoffen die sterk aan de deeltjes hechten, komen later uit de kolom dan stoffen die weinig hechten. Bij peptiden wordt vaak een zogenoemde reversed-phase kolom gebruikt, bijvoorbeeld een C18-kolom. Meer over laboratoriumkolommen lees je in Productsamenstelling analyseren: HPLC en massaspectrometrie uitgelegd.

Detector

Aan het einde van de kolom meet een detector wat er langskomt. Vaak is dat een UV-detector, die meet hoeveel licht een stof opneemt bij een bepaalde golflengte. Een HPLC kan ook gekoppeld zijn aan een massaspectrometer. Dat heet dan LC-MS.

Software

De computer zet het signaal van de detector om in een grafiek: het chromatogram.

Het chromatogram lezen

Een chromatogram is een grafiek met:

• op de horizontale as de tijd (meestal in minuten),
• op de verticale as de sterkte van het signaal.

Elke stof die de detector ziet, verschijnt als een piek.

Retentietijd

De tijd waarop een piek verschijnt, heet de retentietijd. Onder dezelfde omstandigheden komt dezelfde stof steeds op ongeveer dezelfde tijd uit de kolom. Daardoor kan een lab een piek vergelijken met een referentiestof: komt die op dezelfde tijd binnen, dan is dat een aanwijzing dat het om dezelfde stof gaat.

Piekoppervlak

Het oppervlak onder een piek is een maat voor de hoeveelheid signaal. Het zuiverheidspercentage op een rapport is meestal het oppervlak van de hoofdpiek gedeeld door het totale oppervlak van alle pieken.

Waar je op let

• Is er één duidelijke hoofdpiek?
• Zijn er kleine pieken ervoor of erna? Dat kunnen bijproducten zijn.
• Heeft de hoofdpiek een “schouder”? Dan komt er mogelijk een andere stof bijna tegelijk uit.
• Is de hele grafiek zichtbaar, of alleen een uitsnede?

Wat HPLC wel en niet vertelt

Wel

• Hoeveel verschillende zichtbare componenten er in een monster zitten.
• Hoe groot het aandeel van de hoofdcomponent is (zuiverheid).
• In combinatie met een referentiestof: een aanwijzing voor identiteit en een schatting van de hoeveelheid.

Niet

• Stoffen die de detector niet ziet, zoals water en veel zouten. Lees daarover Zuiverheid versus netto peptidegehalte.
• Zonder referentie of massaspectrometrie: zekerheid over welke stof de hoofdpiek is.
• Iets over werking of veiligheid van een stof.

HPLC, UHPLC en UPLC

UHPLC (ook UPLC genoemd) is een doorontwikkeling met kleinere deeltjes in de kolom en een nog hogere druk. Het geeft vaak scherpere pieken en snellere metingen. Voor de lezer van een rapport is het principe hetzelfde.

Waarom de methode op een rapport hoort

Dezelfde stof kan er op een andere kolom, met een andere gradiënt of bij een andere golflengte anders uitzien. Een percentage zonder methode is daardoor moeilijk te vergelijken. Een goed rapport vermeldt minimaal de kolom, de mobiele fase of gradiënt en de detectiegolflengte. Meer hierover op de pagina Laboratorium en in Wat is een COA?.

Veelgestelde vragen

Waar staat HPLC voor?

High Performance Liquid Chromatography, in het Nederlands hogedruk-vloeistofchromatografie.

Wat is het verschil tussen HPLC en LC-MS?

Bij HPLC meet meestal een UV-detector de stoffen. Bij LC-MS is de vloeistofchromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer, die ook de massa van elke stof meet.

Wat is een retentietijd?

De tijd tussen het inspuiten van het monster en het moment waarop een stof de detector bereikt.

Wat betekent purity op een HPLC-rapport?

Het aandeel van de hoofdpiek in het totale signaal van alle pieken die de detector ziet.

PeptidePraat is een informatieplatform zonder eigen lab. Dit artikel is geen gebruiksadvies en geen medisch advies.