Productsamenstelling analyseren: HPLC en massaspectrometrie uitgelegd

Wat zit er in een monster, en in welke verhouding? Dat is de vraag achter elke productsamenstelling analyse. Bij peptiden gebruiken laboratoria daarvoor vooral twee technieken: HPLC (vloeistofchromatografie) en massaspectrometrie. In dit artikel leggen we uit hoe die werken, wat een HPLC-kolom is en hoe je de uitkomsten op een rapport kunt lezen.

Wat is een productsamenstelling analyse?

Een productsamenstelling analyse is een meting waarmee een lab vaststelt welke stoffen in een monster aanwezig zijn en hoeveel. Bij peptiden draait het meestal om drie vragen:

1. Identiteit: is de hoofdcomponent echt het verwachte peptide?
2. Zuiverheid: hoeveel van het gemeten signaal komt van die hoofdcomponent?
3. Gehalte: hoeveel milligram van de stof zit er in het monster?

Geen enkele techniek beantwoordt alle drie de vragen perfect. Daarom combineren labs vaak methoden.

HPLC: scheiden in de tijd

HPLC staat voor High Performance Liquid Chromatography. Het principe is scheiden: de verschillende stoffen in een monster worden van elkaar gescheiden zodat ze één voor één gemeten kunnen worden.

Hoe een HPLC-meting verloopt

1. Het monster wordt opgelost en in kleine hoeveelheid in het systeem gespoten.
2. Een pomp duwt een vloeistof (de mobiele fase) onder hoge druk door een kolom.
3. In de kolom houden de componenten van het monster elk een andere tijd vast.
4. Aan het einde meet een detector wat er uit de kolom komt.
5. De software tekent een chromatogram: een grafiek met pieken.

De tijd waarop een stof uit de kolom komt, heet de retentietijd. Het oppervlak onder een piek is een maat voor hoeveel signaal die stof geeft.

UHPLC of UPLC

UHPLC (ook wel UPLC genoemd) werkt met kleinere deeltjes in de kolom en hogere druk. Dat geeft vaak scherpere pieken en snellere metingen. Het principe is hetzelfde.

Laboratoriumkolommen: wat is een HPLC-kolom?

De kolom is het hart van de HPLC. Het is een smalle buis, meestal van roestvrij staal, gevuld met zeer kleine deeltjes. Die vulling heet de stationaire fase.

Reversed-phase kolommen voor peptiden

Voor peptiden worden meestal reversed-phase kolommen gebruikt. De deeltjes zijn vaak van silica met een waterafstotende laag van koolstofketens. De bekendste is de C18-kolom (ketens van 18 koolstofatomen). Er bestaan ook C8- en C4-kolommen, die minder sterk vasthouden en soms worden gebruikt voor grotere of sterk waterafstotende moleculen.

Peptiden die meer waterafstotende aminozuren bevatten, blijven langer aan de kolom hangen. De mobiele fase is meestal een mengsel van water en acetonitril, waarbij het aandeel acetonitril tijdens de meting langzaam oploopt. Dat heet een gradiënt. Vaak wordt een klein beetje zuur toegevoegd, zoals trifluorazijnzuur (TFA) of mierenzuur.

Waar de kolom het verschil maakt

Laboratoriumkolommen verschillen in:

• lengte (bijvoorbeeld 50 tot 250 millimeter): langer geeft meestal betere scheiding, maar een langere meting;
• binnendiameter;
• deeltjesgrootte (enkele micrometers of kleiner): kleinere deeltjes geven scherpere pieken, maar vragen hogere druk;
• poriegrootte: voor grotere peptiden en eiwitten worden kolommen met grotere poriën gebruikt;
• type stationaire fase (C18, C8, C4 en andere).

Daarom kan dezelfde stof op twee verschillende kolommen een ander chromatogram geven. Een goed rapport vermeldt welke kolom, welke gradiënt en welke detectiegolflengte zijn gebruikt.

De detector

Bij peptiden is de detector meestal een UV-detector. De peptidebinding absorbeert licht in het lage UV-gebied, rond 210 tot 220 nanometer. Stoffen die geen UV-licht absorberen, zoals water en sommige zouten, ziet deze detector niet.

Zuiverheid lezen in een chromatogram

Het zuiverheidspercentage is meestal het oppervlak van de hoofdpiek gedeeld door het totale oppervlak van alle pieken. Let bij een chromatogram op:

• Eén duidelijke hoofdpiek met weinig kleine pieken eromheen.
• Schouders: een bult aan de zijkant van de hoofdpiek kan wijzen op een stof die bijna tegelijk uit de kolom komt.
• Een volledige grafiek: de hele tijdsas moet zichtbaar zijn, niet alleen een uitsnede rond de hoofdpiek.
• De methode: zonder kolom en golflengte is een percentage moeilijk te vergelijken.

Zuiverheid zegt niet hoeveel milligram er in het monster zit. Daarvoor is een vergelijking met een referentiestandaard nodig, of een aparte bepaling van het netto peptidegehalte.

Massaspectrometrie: de massa meten

Massaspectrometrie (MS) meet de massa van moleculen. Eigenlijk meet het apparaat de verhouding tussen massa en lading (m/z).

Hoe het werkt

1. Het monster wordt omgezet in geladen deeltjes (ionen). Bij peptiden gebeurt dat meestal met elektrospray-ionisatie (ESI).
2. De ionen worden in het apparaat gescheiden op basis van hun m/z.
3. De detector telt hoeveel ionen er bij elke m/z aankomen.

Peptiden kunnen meerdere ladingen dragen. Eén peptide geeft dan meerdere signalen, bijvoorbeeld met één, twee of drie extra protonen. De software rekent die terug naar de massa van het molecuul.

Wat MS vertelt

De gemeten massa wordt vergeleken met de berekende massa van de verwachte sequentie. Komt die binnen een kleine marge overeen, dan is dat een sterke aanwijzing voor de identiteit. MS kan ook bijproducten opsporen, zoals een keten waarin één aminozuur ontbreekt.

Wat MS niet vertelt

• Niet automatisch hoe zuiver een monster is.
• Niet altijd de volgorde van de aminozuren: twee peptiden met dezelfde aminozuren in een andere volgorde hebben dezelfde massa. Daarvoor is MS/MS of peptide mapping nodig.

LC-MS: de twee gecombineerd

Bij LC-MS is een vloeistofchromatograaf direct gekoppeld aan een massaspectrometer. Elke piek uit de kolom krijgt zo ook een massa. Dat maakt het mogelijk om niet alleen te zien dát er een nevenpiek is, maar ook wat die nevenpiek waarschijnlijk is. Voor LC-MS wordt vaak mierenzuur gebruikt in plaats van TFA, omdat TFA het MS-signaal kan onderdrukken.

Andere analyses die je tegenkomt

• Endotoxinen (LAL): bacteriële restproducten.
• Karl Fischer: watergehalte.
• GC: restoplosmiddelen.
• ICP-MS: zware metalen.
• Aminozuuranalyse: de verhouding van aminozuren en het netto peptidegehalte.

Een peptide test laten doen

Wie een monster wil laten analyseren, stuurt dat naar een analyselab en kiest welke tests het lab moet doen. Op Testlabs staat een overzicht van labs die vaak op rapporten van research peptides voorkomen en hoe hun rapporten te verifiëren zijn. Het resultaat is een rapport, vaak COA genoemd. Hoe je dat leest, staat in Wat is een COA? en Hoe lees je een Janoshik-testuitslag?.

Veelgestelde vragen

Wat is een HPLC-kolom?

Een smalle buis gevuld met kleine deeltjes, waarin de stoffen uit een monster van elkaar worden gescheiden. Voor peptiden is dat meestal een reversed-phase kolom, zoals een C18-kolom.

Wat zijn laboratoriumkolommen?

Een verzamelnaam voor de scheidingskolommen in chromatografie, zoals HPLC- en GC-kolommen.

Wat is het verschil tussen HPLC en massaspectrometrie?

HPLC scheidt stoffen en laat zien hoeveel signaal elke stof geeft. Massaspectrometrie meet de massa van moleculen. HPLC zegt vooral iets over zuiverheid, MS vooral over identiteit.

Is 99% HPLC-zuiverheid hetzelfde als 99% peptide in het poeder?

Nee. Water, zouten en tegenionen zijn vaak niet zichtbaar voor de UV-detector. Het werkelijke peptidegehalte kan lager liggen.

Waarom staat de kolom op een rapport?

Omdat de kolom bepaalt hoe goed stoffen worden gescheiden. Zonder die informatie is een chromatogram moeilijk te beoordelen of te vergelijken.

PeptidePraat is een informatieplatform zonder eigen lab. Dit artikel is geen medisch advies en geen gebruiksadvies.